体内细胞治疗迎来新突破，普瑞基准依托“生物学+AI”提供一站式生物分析解决方案

近年来，随着细胞与基因治疗（CGT）领域的快速发展，体内细胞治疗（in vivo cell therapy）正成为行业瞩目的焦点。与传统体外改造的细胞疗法相比，体内细胞治疗通过慢病毒、RNA-LNP等递送系统，直接在患者体内“原位改造”细胞，极大缩短了制备周期、降低了治疗成本，为自身免疫病与肿瘤治疗带来了全新可能。

如上图所示，2025年9月，《柳叶刀》发表了基于慢病毒载体的体内BCMA CAR-T疗法治疗多发性骨髓瘤的临床研究结果，同时《新英格兰医学杂志》发表全球首项基于mRNA-LNP的体内CAR-T治疗红斑狼疮的人体临床研究，这两项重磅研究代表着目前体内细胞治疗的两大技术策略（慢病毒载体和RNA-LNP）和主流方向，标志着该技术正式从概念走向临床。值得一提的是，这两项重磅研究全部是在中国境内主导进行的，也代表着中国医药行业在体内细胞治疗领域已经处于国际领先地位。

同样是在2025年09月底，Carl H. June教授联合一众细胞治疗领域专家在《nature review》杂志上发表“In vivo chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy”综述，详细阐述了体内细胞治疗的现状和未来的发展方向。目前慢病毒载体和RNA-LNP（环状RNA和mRNA等）各有优缺点、各有擅长的疾病领域，未来哪种载体更适合临床应用需要通过更多的临床数据来验证。

体内细胞治疗临床试验和IIT中涉及的分析指标，除了参考2024年发布的《细胞治疗产品临床药理学研究技术指导原则(试行)》，还应参照基因治疗相关的检测范畴。我们将从以下两个主流的体内细胞治疗方向（慢病毒和RNA-LNP）来阐述体内细胞治疗的生物分析策略。

体内（In-vivo）细胞治疗（慢病毒载体）检测解决方案

细胞动力学/药代动力学（Pharmacokinetics）

体内细胞治疗产品的体内过程是影响有效性和安全性的重要因素，应根据具体产品采用适宜的分析方法考察细胞动力学/药代动力学特征。慢病毒载体进行体内细胞治疗，一般表达效率最高可以达到30-65%甚至更高一些，且会持续长期表达。慢病毒载体的体内细胞治疗除了进行体外细胞治疗常测的CAR+细胞浓度检测（通常采用流式细胞术方法检测）和外源基因拷贝数检测（通常采用qPCR或dPCR方法检测）以外，还需要额外增加对于病毒颗粒本身的检测。常见的慢病毒物理滴度检测方法包括P24 ELISA法（检测载体样本中的p24蛋白）、qPCR法测慢病毒滴度（定量测定血浆中含基因组的慢病毒颗粒）等常用方法，其他新技术检测病毒颗粒数，如病毒计数仪法、纳米颗粒跟踪分析法、场流分离-多角度激光光散射法等，应关注方法对待测病毒类型的适用性。目前qPCR法以慢病毒载体基因组中的保守区（LTR）为靶标，能够定量、高灵敏、快速的检测血浆中的病毒总颗粒数，是目前常用且比较容易搭建的检测方法。

药效学 (Pharmacodynamics, PD)

体内细胞治疗药效学的检测指标，基本上和体外细胞治疗是一致的，也是会重点关注生物标志物等药效学指标。如可通过配体结合试验（LBA）检测IL-6、IFNs、TNFs和IL-2等细胞因子来评价T细胞的活化特性。检测一些特定蛋白的活性、持续时间和变化情况等也可以反映药效，另外淋巴细胞亚群分析也可对细胞治疗产品的有效性提供有意义的数据支持。针对血液系统肿瘤的体内细胞治疗产品，血细胞的检测和监控是免疫细胞治疗产品药效学分析的重要内容。

免疫原性（Immunogenicity）

慢病毒载体进行体内细胞治疗，一般认为会稳定转染免疫细胞并整合到人的基因组中，在体内可以长期存活并表达相应的转基因产物，其外源组分和表达产物均可能引起免疫反应。 因此，建议对外源组分和表达产物均进行免疫原性检测方法的开发。如果有共表达产物，关注对共表达产物进行免疫原性检测方法的开发，在能够获得scFv/蛋白/抗体和阳性对照抗体的情况下，常见的开发模式是采用桥连法，能够特异性的检测相关的ADA。

除了和体外细胞治疗一样的免疫原性以外，当慢病毒载体回输到人体内时，针对病毒本身也会产生免疫原性，因此针对慢病毒本身的免疫原性是体内细胞治疗要重点考虑的一个方向。一般人体免疫系统产生抗体的最主要、最有效的靶标是病毒颗粒表面的包膜糖蛋白和衣壳蛋白。因此，为了全面的评估针对慢病毒本身的免疫原性，有以下图中几种开发策略：

1.采用直接法检测针对慢病毒的广谱ADA：把慢病毒颗粒包被在板底，由于慢病毒本身很难进行标记（主要是因为慢病毒的①结构脆弱性：慢病毒的囊膜对物理化学处理敏感，易失活；②靶点稀少与异质性：表面可用于共价标记的化学基团（如赖氨酸的氨基）数量有限且分布不均；③功能敏感性：标记反应容易损伤其感染性所必需的表面糖蛋白（如VSV-G）），所以用anti-human Fc antibody进行检测，这种方法的优势是能够检测到和慢病毒本身结合的所有抗体ADA，缺点是会产生较多的背景信号，特异性不够好。或者利用抗体提取和酸解原理，采用亲和捕获洗脱法（ACE）来检测针对慢病毒本身的所有抗体ADA。

目前体内CAR-T经常会把慢病毒上的包膜蛋白EnV改造成假型化载体（使用VSV-G），人体内产生的抗体主要针对VSV-G蛋白，则需要针对VSV-G蛋白去开发方法。另外，p24是构成慢病毒粒子衣壳的主要结构蛋白，每个病毒颗粒含有约2000个p24蛋白分子。针对p24本身的抗体检测方法也可以考虑代表慢病毒的免疫原性。

因此直接法的检测抗体也可以考虑换成标记好的包膜蛋白（VSV-G）或衣壳蛋白（p24），这样会减少很多背景信号。

2. 如上文所述，也可以采用针对包膜蛋白VSV-G和针对衣壳蛋白p24进行ADA检测，这两个蛋白的ADA目前认为在一定程度上也能够代表针对慢病毒的免疫原性，优势是检测方法特异性更好，缺点是可能无法完全表征针对慢病毒的全部抗体。

3. 如下图所示，目前为了使体内细胞疗法更具有靶向性，能够特异性的转染体内的免疫细胞。一般都会在慢病毒表面偶联一些特异性的抗体，比如CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等，人体针对这些偶联抗体可能也会产生一定的免疫原性，虽然针对这些免疫标记物抗体的免疫原性可能会极低，建议前期进行研究的时候也可以充分和全面的考虑，避免漏掉一些信息。

安全性检测（Safety）

以慢病毒为载体的体内细胞疗法和体外细胞疗法，都会关注的是：慢病毒载体因其可整合靶细胞基因组的特性，对其安全性监管的重点主要集中在可复制性慢病毒与载体插入位点的检测。普瑞基准已经自主研发了一套高效的慢病毒复制型病毒（RCL）检测和慢病毒整合位点（ISA）检测方法，如VSV-G QPCR法检测包膜基因核酸片段、p24结构蛋白检测法，以及NGS平台检测ISA的方法，目前这些方法都用于注册临床试验中的样本检测。

对于体内细胞疗法，可能还需要额外关注脱靶风险，比如非T细胞转导可能引发毒性（如肝毒性），普瑞基准在脱靶检测评估方面依托公司强大的AI+生信分析能力，为不同的细胞治疗产品提供全面精准的评估。

体内（In-vivo）细胞治疗（靶向脂质纳米颗粒（tLNPs））检测解决方案

细胞动力学/药代动力学（Pharmacokinetics）

靶向脂质纳米颗粒（tLNPs）的体内细胞治疗，除了进行体外细胞治疗常测的CAR+细胞浓度检测和外源基因拷贝数/mRNA检测以外，如果需要额外关注脂质纳米颗粒在人体内的浓度变化、分布和清除过程，则需要采用LC-MS/MS等技术进行及时检测。脂质纳米颗粒的PK特性与传统药物不同，主要表现为快速组织分布、缓慢消除和肝/肾清除特征。早期临床研究阶段如需要探索相关机制，可以考虑进行全面的药代动力学分析。

靶向脂质纳米颗粒（tLNPs）的体内细胞治疗的表达效率一般会比慢病毒载体的低一些，比如递送物质如果是mRNA的话，CAR表达可能仅能持续2-3天，目前很多公司也在使用环状RNA（cRNA）作为递送物质，CAR表达能够延长至5-10天。RNA-LNP体内细胞治疗的愿景是既能获得持久、高效的蛋白表达，又无需永久性改变细胞基因组。

药效学 (Pharmacodynamics, PD)

靶向脂质纳米颗粒（tLNPs）的体内细胞治疗的药效学检测指标基本上和上述的慢病毒载体体内细胞治疗一样的，此处不再赘述。

免疫原性（Immunogenicity）

靶向脂质纳米颗粒（tLNPs）的体内细胞治疗，也需要对外源组分和表达产物均进行免疫原性检测方法的开发。开发方法和体外细胞治疗一样，比如需要针对scFv进行ADA检测。

除了和体外细胞治疗一样的免疫原性以外，由于tLNPs作为载体回输到人体内时，不会使mRNA整合到细胞基因组，而是短暂表达，因此需要多次给药，并且为了使表达效率提高，目前的给药剂量也较大，所以人体还是会产生一定的免疫原性。目前常用的LNP载体通常认为是免疫原性很低的载体，以LNP本身制备ADA阳性对照（Positive control）比较困难，一般情况下不考察LNP总体的免疫原性。但是值得注意的是LNP上通常有PEG脂质，其中的PEG修饰成分是潜在的引起免疫原性的物质，并且机体可能存在预存anti-PEG抗体（pre-existing anti-PEG antibodies）也会造成药物清除速度加快等情况。因此通常对于LNP载体的mRNA药物，会建议考察其PEG成分的免疫原性。针对脂质纳米颗粒的PEG2000成分，血液样本的ADA检测应该能够检测到IgG和IgM亚型，可以考虑检测抗PEG IgM和IgG来全面考察针对PEG的ADA。

如下图所示，和慢病毒载体类似的，目前为了使体内细胞疗法更具有靶向性，能够特异性的转染体内的免疫细胞。一般都会在LNP表面偶联一些特异性的抗体，比如CD3、CD4、CD5、CD7、CD8等，人体针对这些偶联抗体可能也会产生一定的免疫原性，考虑和检测方法和上文慢病毒载体的类似，此处不做进一步赘述。 

安全性检测（Safety）

目前普遍认为脂质纳米颗粒（LNP）的安全性是优于慢病毒载体的，主要是mRNA等转染细胞后是瞬时表达，无插入突变风险。这一技术在COVID-19疫苗中得到了史无前例的验证，其高效、安全、可规模化的特性，使其成为in vivo CAR-T领域最具潜力的候选者。

对于靶向脂质纳米颗粒（tLNPs）的体内细胞治疗，也需要额外关注脱靶风险，此处是和慢病毒载体比较类似，。

结语

在目前的体内细胞治疗前沿领域，普瑞基准公司凭借深厚的中心实验室平台与多组学技术积累，为药企提供从方法开发到临床检测的全流程生物分析解决方案，助力体内细胞治疗从实验室走向患者。然而，这类新型疗法的临床开发离不开精准、合规的生物分析支持。从药代动力学到免疫原性，从安全性到生物标志物，每一个环节都需严格验证与标准化检测。普瑞基准是国内为数不多拥有双“C”认证（CAP+CLIA）的实验室，其质量体系不仅能够满足国内临床试验对于中心实验室的要求，也承接了很多国际多中心临床试验（MRCT）项目。

体内细胞治疗正在重塑未来医药的格局。普瑞基准愿与行业伙伴携手，以精准、可靠、高效的生物分析服务，共同推动更多创新疗法早日惠及患者，助力中国CGT走向世界前沿。

作为一家以“多组学+数据挖掘”为特色的新型平台公司，普瑞基准在细胞与基因治疗领域已积累了丰富的项目经验。公司在北京与苏州设有中心实验室，配备流式细胞仪、qPCR/dPCR、MSD、NGS、单细胞测序等先进平台，可为药企提供符合NMPA/FDA要求的生物分析服务。

参考文献

[1] In vivo chimeric antigen receptor (CAR)-T cell therapy, nature reviews drug discovery 2025, https://doi.org/10.1038/s41573-025-01291-5

[2] In-vivo B-cell maturation antigen CAR T-cell therapy for relapsed or refractory multiple myeloma, THE LANCET, Volume 406, issue 10500, P228-231, July 19, 2025

[3] In Vivo CD19 CAR T-Cell Therapy for Refractory Systemic Lupus Erythematosus, Published September 17, 2025; N Engl J Med 2025;393:1542-1544; DOI: 10.1056/NEJMc2509522

【关于普瑞基准】

普瑞基准是一家以“多组学+AI”驱动，专注于创新药转化医学研发服务的新型平台公司。公司为药企提供全球领先水准的生物标志物发现、基于生物标志物的新药临床差异化开发策略、中心实验室检测、药物伴随诊断开发等服务。目前已与多家国内外领先的药企及生物科技公司形成深度合作，助力多个新药的研发和获批。同时，公司也在临床端与合作的药企、医生一道为患者提供先进、精准的检测产品，助力精准检测的临床实践。

文章来源于：公众号普瑞基准